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ELISA中非特異性顯色原因分析

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發表時間:2019-07-18 16:28作者:武漢新啟迪Xinqidi來源:http://www.0458155.buzz

ELISA中非特異性顯色原因分析


【摘要】:影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物,操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至最低限度,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結果。

【關鍵詞】 ELISA 非特異性 顯色

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)自1971年自問世以來,以其敏感性高,特異性強,操作簡便、安全,而廣泛應用于臨床診斷,開創了免疫學診斷的新紀元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究、生產及使用中常常會碰到非特異性問題,本文就在實驗過程中產生的一些原因及如何采取一些措施,消除非特異性顯色作一分析。

1、試劑盒特異性因素

1、1 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板最為常見[1]。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產品的質量差異很大。因此,在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證,評估。

1、2包被物的純度。在酶聯免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。

1、3包被抗體的效價。具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。

1、4 封閉。是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙[2],減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。

2、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物

2、1內源性干擾物:類風濕因子(RF)、黃疸等,類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,多數為IgM類,能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應,從而呈現非特異性顯色。

黃疸血標本中常含有內源性過氧化物酶,如用辣根過氧化物酶為標記物,就有可能產生非特異性顯色。

2、2 外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血,被細菌污染,標本凝集不全等。溶血標本,紅細胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP(辣根過氧化酶)[2],有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久,其中的IgG可發生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,血標本在采集處理時應小心,在冰箱中保存不易過久。

標本凝集不全時,血清中會殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性。

3、操作過程中的問題造成假陽性

3、1加樣

對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋,如果加樣不準就會造成誤差,尤其當稀釋倍數大時,很小的絕對誤差,會導致較大的相對誤差,使陰性(或弱陽性)標本呈陽性(或陰性)。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產生氣泡。目前,大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統處理標本,可較好地避免以上誤差。

3、2洗滌

在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步,應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作,得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關,ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。

3、3 溫育

每種試劑都有其最佳反應模式,其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高,反應時間長,會造成整板本底高,陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴,反應板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發,板上應加蓋。

3、4酶標儀判讀

作為記錄測定結果的儀器,酶標儀的性能穩定與否,決定結果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養,對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長設置要正確,最好使用雙波長,一個檢測波長,一個參比波長,以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,在用酶標儀讀數時最好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同,使用中應詳細閱讀說明書

綜上所述,由于酶聯免疫吸附技術目前在技術上缺乏標準化,盡管目前國際上以及我國有了部分標準血清或參比血清(血清盤)。但由于受方法學及技術條件的限制,在酶聯吸附測定中有時不可避免的會出現一定的非特異性,但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至最低限底,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結果。


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