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抗體常見問題解答

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發表時間:2018-08-23 14:32作者:武漢新啟迪Xinqidi來源:http://www.0458155.buzz

1. Q:多抗和單抗的區別?

A: 多抗是多個B細胞克隆產生的針對多種抗原表位的多種抗體混合物,單抗是一個B細胞克隆產生的針對一種抗原表位的的單一抗體。

2. Q:多抗較單抗的優勢是什么?

A: a.首次制備成本低廉,制備所需技術要求不高,制備周期短。

b. 能識別一個抗原上的多個表位,可在IP等實驗中獲得更好的結果。

c. 多抗因為靶蛋白可在多個表位上結合不止一個抗體分子,有助于放大低表達水平的靶蛋白信號。

d. 能識別出與免疫原蛋白質具有高同源性的蛋白質,或者從非免疫原物種的組織樣品中篩選靶蛋白,例如當未測試物種中的抗原性質未知時,有時會使用多克隆抗體。e. 可識別多個結構域,即使原始抗原的一些空間結構或者序列發生小變化或者部分抗原決定簇變化,仍可以識別抗原,因此有更大的適應性。

3. Q: 多抗較單抗的劣勢是什么?

A: a. 易于產生批次間差異,重新制備成本高。b. 產生大量非特異性抗體,有時可能在某些應用中產生背景信號。

4. Q:單多抗如何選擇?

A: 對抗體的特異性要求高,用量較大或需要長期使用一致的抗體,制備的抗體應用要求多。例如,WB/IP/IF/ICC等,一般選擇單抗。對抗體的特異性要求不高,需要做沉淀和凝集反應的檢測性實驗或者只需做ELISA檢測,一般選擇多抗。

5. Q: WB,IHC,IP/ChIP類型抗體有什么區別?

A: WB:目前最常做的類型,WB識別的蛋白是經過加熱變性之后都變成線性結構的蛋白。

IHC:免疫組化中需要進行固定一步,固定是為了盡量讓細胞的形態結構維持和原有的一致。這種化學物質的固定使蛋白質變性凝固,與天然狀態下的蛋白質有了一定的區別,但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結構。

IP/ChIP:這類實驗是用抗體去結合生理狀態下的蛋白質,因此IP和ChIP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體。

6. Q:目的蛋白分子量為何與實際不符?

A: 當條帶所示的實際大小與理論有偏差時,可能有以下原因導致:蛋白發生如磷酸化、糖基化等翻譯后修飾時條帶會上移,蛋白發生剪切(如前體)時條帶會下移,蛋白存在不同的可變剪切體或亞型,強相互作用大分子存在時變性不徹底。

7. Q: 多抗做WB檢測為何有雜帶?

A: a. 從純化方式來看:采用ProteinA/G純化的多抗摻雜有動物本身產生的對其自身抗原產生的抗體,這些抗體在檢測中會識別樣本中的蛋白而出現雜帶,可以采用抗原親和純化避免雜帶的產生。

b. 從蛋白修飾來看:天然蛋白存在復雜的翻譯后修飾。這點可以通過信息學分析進行解釋。

c.從蛋白翻譯后加工來看:翻譯后蛋白前體經切割可能會使部分蛋白分子量偏小,而天然組織中同時存在蛋白前體和切割加工后的蛋白,二者序列有相同部分,可能會產生雜帶。這點需要通過查閱與目的蛋白相關文獻進行了解。

d.從同源家族蛋白來看:當目的蛋白有同源家族蛋白時,蛋白異構體的存在可能會使分子量偏離預測分子量,因為天然樣本中由同一個mRNA不同的剪接方式進行翻譯形成的蛋白產物也會有相同的抗原表位,同時被抗體識別時會產生雜帶。

e. 從蛋白聚集形式來看:蛋白多聚體的形成,雖然還原條件可以抑制多聚體的形成,但是強烈的蛋白間相互作用在還原條件下也有可能不解聚導致條帶偏大。

8. Q:抗體做WB為何不識別內源樣本?

A: a. 蛋白在天然樣本中的豐度太低,此時需要進行富集或者過表達再進行檢測。b. 如果豐度不低,單抗/多抗不識別內源可能是該抗體識別的表位在天然蛋白中有修飾位點,此時需要對蛋白進行修飾位點的分析。


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