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白細胞介素2的制備及檢定

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發表時間:2019-07-12 16:27作者:武漢新啟迪Xinqidi來源:http://www.0458155.buzz

白細胞介素2的制備及檢定

(一) 原理

白細胞介素2(IL-2)是Th細胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激后,并在白細胞介素1的輔助下,產生的一種可溶性糖蛋白。IL-2是體內重要的廣譜免疫增強因子,臨床上常用于治療免疫缺陷病及腫瘤等。

(二) 材料和方法

1.制備粗制IL-2無菌采血,肝素抗凝,用RPMI1640按1∶1將血液稀釋,然后重層于菲可液面上,以1500r/min離心30min,取白細胞層,用RPMI1640洗2次,按1~3×10-6細胞/ml濃度加入10%胎牛血清RPMI1640,注入一裝有磁棒的大瓶中,置37℃攪拌培養4天,取出,分裝于50ml離心管中,1500r/min離心20min,棄上清液,將細胞懸浮于1%胎牛血清RPMI1640培養液中,使細胞濃度為10-6細胞/ml。同時加入純質PHA1~2μg/ml以及多種B 淋巴母細胞株,使其濃度為10-6細胞/ml,37℃攪拌培養18~24h后,取出以1500r/min離心30min,取上清,用0.45μg濾膜過濾除菌,濾液即為粗制IL-2。

2.制備精品IL-2

(1) 硫酸銨沉淀與真空濃縮透析:在4℃下將硫酸銨粉末按50%飽和量加入上述粗制IL-2中,攪拌2h,12000g離心30min,取上清液,再加入80%飽和硫酸銨,4℃過夜,次日以12000g離心30min,棄上清液,將沉淀溶于0.1%PEG6000的1∶2PBS溶液(pH值7.3)中,置真空負壓濃縮透析器中透析濃縮至所需容量。

(2) Sephadex G100凝膠過濾:用2×180cm的過濾柱及PBS(同上),以80ml/h流速過濾 。將各管洗脫液用紫外分光光度計280nm檢測其OD值。同時將幾種不同分子量的標準蛋白也用相同條件過濾及檢測其OD值,繪出IL-2及標準蛋白OD值的曲線。將各管洗脫液過濾除菌后,作白細胞生物活性試驗,按試驗結果繪出曲線,找出具有最高IL-2活性的幾管洗脫液,混合后,作下一步精制。

(3) Blue Sepharose層析:將上述混合后的洗脫液加入Blue Sepharose柱 中,流速約15ml /h,按每管10ml收集流出液,當樣品全部流出柱中以后,用上述PBS洗滌樣品柱,再用梯度NaCl溶液(從0.075mol/L至0.6mol/L NaCl的PBS溶液)洗脫,按2ml/管收集洗脫液。NaCl溶液梯度及流速均由梯度混合器調節控制。洗脫完畢后,作各管OD值及NaCl濃度的測定。各管洗脫液過濾除菌后,作出生物活性測定。將峰值前后的數管洗脫液混合,即為精制的IL-2.

2。置-20℃冰箱保存。

(三) 檢定

1.活性測定用10%胎牛血清RPMI1640將上述IL-2稀釋為50%、25%、12.5%、6.25%,而后再將每個百分濃度以及100%濃度的IL-2倍比稀釋,自1∶2至1∶128,將每個稀釋度分別加入多孔板的孔中,每孔0.1ml。然后取CT6細胞株(小鼠的IL-2依賴性T細胞株), 調整濃度為10-6細胞/ml,每孔加入0.1ml,同時用培養基代替IL-2作對照。將多孔板培養24h后,取出按每孔1μci的濃度加H3標記胸腺嘧啶核苷繼續培養4h。取出后用ME SHⅡ細胞收集器過濾洗滌細胞,用β計數器測定各孔細胞的cpm。必要時按此結果繪出曲線,確定活性單位。

2.蛋白含量測定采用分光光度計,分別測得OD280及OD260,然后按下式計算:蛋白含量(mg/ml)=(1.44×OD280-0.75×OD260)×稀釋倍數。

3.毒性試驗及細菌檢查參考胸腺肽制備部分。

(四) 注意事項

IL-2的制備過程類似細胞培養的過程,因此,其注意事項也類似細胞培養。IL-2活性測定采用的是同位素摻入法,因此須按要求操作,防止同位素擴散和污染。


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