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瓜氨酸化LL-37的研究:在人氣道中的檢測,抗菌作用和生物物理特性

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發表時間:2020-02-11 15:45作者:武漢新啟迪Xinqidibio來源:www.0458155.buzz

瓜氨酸化LL-37的研究:在人氣道中的檢測,抗菌作用和生物物理特性

摘要

抗菌肽LL-37的精氨酸殘基可以被肽基精氨酸去亞氨酶瓜氨酸化,從而減少該肽的正電荷。值得注意的是,尚未在人類樣品中檢測到瓜氨酸化的LL-37。此外,瓜氨酸化的LL-37的功能和生物物理特性尚未得到充分研究。這項研究的目的是檢測人支氣管肺泡灌洗液中的瓜氨酸化LL-37,并確定瓜氨酸化LL-37的抗菌和生物物理特性。支氣管內暴露于脂多糖后,從健康的人類志愿者獲得BAL液。合成肽用于細菌殺滅測定,透射電子顯微鏡,等溫滴定量熱法,質譜和圓二色性。使用靶向蛋白質組學,我們能夠檢測BAL液中的天然和瓜氨酸化的LL-37。瓜氨酸肽沒有殺死大腸桿菌也不會裂解人的紅細胞。兩種肽都具有相似的α-螺旋二級結構,但瓜氨酸化的LL-37在較高溫度下更穩定,如圓二色性所示。總之,瓜氨酸化的LL-37存在于人的氣道中,瓜氨酸化會破壞細菌的殺滅力,這表明凈正電荷對于抗菌和膜裂解作用很重要。瓜氨酸化可能通過改變關鍵功能而充當AMP功能的穩態調節器。

介紹

抗菌肽和蛋白質(AMP)是先天免疫的重要組成部分,具有針對細菌,真菌和病毒的廣譜抗菌活性1。AMPs由上皮細胞和吞噬細胞主動產生和分泌,并有助于清除病原微生物的粘膜表面并消除細胞內病原體2。此外,由于AMP具有免疫調節活性,例如起信號分子的作用,并具有將嗜中性粒細胞和巨噬細胞募集到感染部位的能力,因此它們也被稱為宿主防御肽(HPD)。的HDP取決于上下文同時顯示親和抗炎活性3,4。

在目前研究的所有哺乳動物中都檢測到了AMP的cathelicidin家族。cathelicidin家族的AMPs具有保守的N末端cathelin域和可變的C末端域,它們在蛋白水解后構成了活性抗菌肽5。直到日期,LL-37是在人類中的唯一的導管素已經鑒定并且它具有對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的抗微生物活性6,7,8。LL-37是一種陽離子和兩親性肽,由37個氨基酸組成(表   1),它與細菌帶負電荷的膜結合,導致細菌膜完整性受到破壞,進而導致細菌死亡9,10。在由大單層磷脂囊泡(LUVs)組成的模型膜系統中,發現LL-37引起帶負電荷的囊泡的膜滲漏,但不引起兩性離子囊泡 11的滲漏。此外,LL-37具有免疫調節特性,如脂多糖的中和(LPS) -誘導的巨噬細胞活化,細胞趨化活性朝免疫細胞 12,13和自體吞噬的活化 14。

表1本研究中使用的合成LL-37肽的序列及其理化特性。

值得注意的是,在炎癥條件下,鈣依賴性肽基精氨酸脫亞氨酶(PADs)在與人cathelicidin LL-37 15相同的位置表達。這些酶催化瓜氨酸化,翻譯后修飾(PTM),其中帶正電荷的精氨酸殘基轉化為瓜氨酸,從而減少了目標蛋白質或肽12的電荷。在人類中,有五種同型的PAD(PAD1、2、3、4和6),它們的組織分布不同16。PAD2和PAD4均在嗜中性粒細胞中表達,其中PAD2位于細胞質中,而PAD4主要位于細胞核中17。PAD4通過瓜氨酸化帶正電荷的組蛋白,參與嗜中性粒細胞胞外捕獲(NETs)和NETosis的形成,從而導致染色質的縮聚18。重要的是,在體外研究已經表明,重組PAD2和PAD4導致不同程度的瓜氨酸化的精氨酸殘基在LL-37,這導致其LPS中和活性的降低的總肽充電和廢除15,19。

考慮到PAD酶的廣泛特異性及其在肺部炎癥過程中的共表達,有理由建議LL-37可以作為肺中PAD活性的底物。但是,尚未在人肺樣品中檢測到瓜氨酸化的LL-37,而瓜氨酸化的LL-37的推定作用仍然不清楚。因此,我們假設瓜氨酸化可能發生在人的肺部,并且該PTM改變了LL-37的微生物學和生物物理功能。因此,我們設計了一系列實驗,通過將靶向蛋白分析應用于從健康人類志愿者中支氣管內暴露于LPS后的人支氣管肺泡灌洗(BAL)液中,以驗證這一假設,目的是鑒定瓜氨酸化的LL-37 。此外,

結果

支氣管內暴露于LPS后健康志愿者的BAL液中存在瓜氨酸化的LL-37

鑒于本地LL-37和PAD4在人的肺部炎癥過程中高度表達15,20,我們設置了識別這些條件下,LL-37的瓜氨酸的變體。我們利用健康志愿者(n = 10)從支氣管內暴露于LPS的無細胞BAL液樣本中收集并使用反相色譜將其分離成62個餾分(F1-F62)(圖   1A)。為了篩選LL-37肽的變體,利用單克隆抗LL-37抗體或針對LL-37 Cit5的多克隆血清對組分進行斑點印跡分析(圖   1B)。在餾分F26 – F30中檢測到與天然LL-37相對應的信號。值得注意的是,篩選還顯示了在級分F22-F24和F28-F30中對應于LL-37 Cit5的信號。為了驗證這些發現并排除交叉反應性,使用目標LC-MS / MS方法進一步處理了餾分F22-F31。首先,通過ESI-MS-PRM對合成的LL-37,LL-37 Cit3和LL-37 Cit5進行了分析,以研究其電離和碎片化特性。基于這些觀察結果,選擇了一組15個具有高電荷態的獨特碎片離子來監測更長的碎片離子(表   2)。碎片離子組用于鑒定瓜氨酸化的LL-37肽的天然和不同變體(圖   1C)。結果表明在餾分F26-F29中可以清楚地檢測到天然LL-37,而在相同餾分中則檢測到LL-37 Cit3和LL-37 Cit5。在級分F22-F24中也發現了與天然LL-37,LL-37 Cit3和LL-37 Cit5相對應的碎片離子,但強度低得多(圖1C中的星號   ,表   S1)。因此,基于MS分析,在從暴露于LPS的健康志愿者那里獲得的無細胞BAL液中檢測到LL-37肽的天然和瓜氨酸化形式。

圖1
圖1

Identification of citrullinated LL-37 in BAL fluid from healthy volunteers exposed to LPS in the lungs. Healthy human volunteers were exposed to LPS and after 24?h, BAL fluid samples were collected. (A) Reversed-phase chromatography of 0.5?mg peptide/protein extract from the BAL fluid samples. Absorbance at 214?nm is indicated on the left Y-axis and concentration of acetonitrile (ACN) on the right Y-axis. The blue shaded area indicates fractions F22 to F31. (B) Dot blot detection of native and citrullinated LL-37 in the fractions of the BAL fluid extract using a monoclonal antibody against native LL-37 and a polyclonal serum raised against LL-37Cit5. (C)使用LC-ESI-MS-PRM方法分析BAL液提取物的餾分(F22-F31)。在具有不同強度的每種肽的級分(F22-F31)中清楚地檢測到了天然LL-37,LL-37 Cit3和LL-37 Cit5特有的內源碎片離子(表   2)。星號(*)表示以非常低的強度檢測對應于天然LL-37,LL-37 Cit3和LL-37 Cit5的碎片離子(請參見表   S1)。

表2通過LC-ESI-MS-PRM方法分析的15種天然和瓜氨酸化LL-37肽的最強片段離子。

瓜氨酸消除了LL-37的抗微生物和膜干擾作用

知道人類BAL液21中存在天然LL-37 ,我們確定了瓜氨酸化對細菌殺滅的影響。如所期望的,合成的天然LL-37(表   1)顯示出對大腸桿菌的有效抗菌活性,并且以劑量依賴性方式降低了菌落計數單位(CFU)水平。相反,完全瓜氨酸化的肽LL-37 Cit5缺乏抗菌活性(圖   2A)。值得注意的是,一個精氨酸殘基的瓜氨酸化足以消除40μM時的抗菌活性,但是在濃度增加(80μM)時,具有一個單一瓜氨酸化的肽會使細菌的生長減少3 log個單位(圖   2B)。)。在本研究的以下實驗中,除非另有說明,否則我們將天然肽與完全瓜氨酸化的肽(LL-37 Cit5)進行了比較。接下來,使用檢測核酸的通透性標記物sytox green測試了肽誘導膜泄漏的能力。大腸桿菌中,天然LL-37以劑量依賴性方式引起膜通透性,從2.5μM到80μM。相反,在2.5–10μM的濃度下,瓜氨酸化的LL-37不會引起泄漏,而在20–80μM的濃度下,則觀察到輕微的滲透性(圖   2C)。為了可視化天然和瓜氨酸化的LL-37肽如何與大腸桿菌相互作用,進行了透射電子顯微鏡(TEM)研究(圖。 2D)。總體而言,未經處理的細菌在細胞質中具有完整的膜以及DNA和核糖體的均勻胞內分布(分別為亮區和暗區)。30分鐘后,與未處理細菌相比,暴露于50μM天然LL-37會導致膜小泡釋放并引起細胞內變化,例如DNA聚集和核糖體縮合。處理2小時后,觀察到明顯的DNA分離進入細胞中心,而核糖體簇變得更密集并指向內膜。在200μM的肽濃度下,天然LL-37損害了膜的完整性,并增加了核糖體的聚集和細胞裂解。相反,用50μMLL -37 Cit5處理在30分鐘和2小時內,沒有導致任何形態變化。僅在高濃度(200μM)的LL-37 Cit5中,在某些細菌中觀察到一些核糖體簇,表明細胞受到壓力(圖   2D)。為了評估LL-37 Cit5結合完整細菌表面的能力,將熒光標記的肽與大腸桿菌一起孵育1小時。5-FAM-LL-37相比,若丹明-B-LL-37 Cit5無法與大腸桿菌相互作用,這也導致了細胞破裂和細胞碎片的釋放,如在共聚焦顯微鏡圖像合并圖中所看到的(圖   2E))。為了研究瓜氨酸化LL-37對真核細胞膜的影響,使用人紅細胞測定了瓜氨酸化LL-37的溶血活性。天然LL-37在20μM時會溶血約8%的紅細胞,而瓜氨酸化的LL-37不會引起任何溶血(圖   S1)。

圖2
圖2

天然和瓜氨酸化的LL-37的抗菌和破壞膜性能。(A)將 大腸桿菌 ATCC 29522(5×10 7 CFU / ml)與不同濃度的天然LL-37和完全瓜氨酸化的LL-37肽或(B)部分瓜氨酸化的肽在37°C 共同孵育3小時然后通過CFU確定殺菌活性(3個獨立實驗的數據代表)。(C)將 大腸桿菌(5×10 7 CFU / ml)與天然LL-37或LL-37 Cit5(0–80 μM)混合,然后通過Sytox Green核酸染色分析內膜通透性(代表3個獨立實驗的數據)。(D)未經處理或用天然LL-37或LL-37 Cit5(50和200 μM)處理0.5小時或2小時的大腸桿菌的5×10 8 CFU / mL的透射電鏡圖像。比例尺,500 nm。(E)在LB 中將 10 6 CFU / mL的大腸桿菌與熒光標記的LL-37或LL-37 Cit5在40 μM下混合1小時(數據代表2個獨立實驗)。誤差線顯示SEM。統計顯著性通過雙向ANOVA評價(A)或多個t-檢驗():對-通過分表示的值; (<0.05 *,<0.01 **,<0.001 ***,<0.0001 ****)。

天然LL-37和LL-37Cit5表現出不同的LPS結合特性

由于細菌膜的完整性明顯受天然LL-37的影響,而不受LL-37 Cit5的影響,因此我們檢查了這些肽與LPS之間相互作用的內在差異是否可以解釋這種作用。為了表征LL-37和LL-37 Cit5與LPS 的體外結合,在0.1%TFA中進行了ITC。將LL-37或LL-37 Cit5滴定到LPS溶液中,表明LPS與天然LL-37(圖3A)和LL-37 Cit5(圖   3B之間都有清晰的結合 )。對熱成像圖的進一步分析表明,結合由多個步驟組成,在相對較低的肽濃度下發生初始結合事件,然后在較高的肽濃度下發生第二次結合事件(下圖)。結合曲線分析表明,兩種肽在第一次和第二次結合過程中均表現出相似的親和力,但是,第二次結合事件顯示的LL-37 Cit5的化學計量比天然LL-37(n = 0.5)高0.2)。結合能的分析表明,與LL-37 Cit5相比,天然LL-37的結合更受焓驅動,提示天然LL-37上帶電殘基起這種結合作用。此外,與第二次結合事件相比,第一次結合事件對天然LL-37和LL-37 Cit5均表現出更高的焓,這表明低濃度下的初始結合涉及與LPS膠束表面上帶電殘基的相互作用,而第二次結合事件最可能涉及與LPS疏水性內部脂質的相互作用增加(表   3)。

圖3
圖3

天然和瓜氨酸化的LL-37與LPS的相互作用。通過將天然LL-37(A)或LL-37 Cit5B滴定到LPS-O111:B4溶液中對ITC實驗進行分析。每300秒,將2 μL肽的0.1%TFA溶液(200 μM)滴定到164 μL LPS溶液(62.5 μM)中。測量熱速率(上圖)和歸一化積分熱量對LPS和肽之間的摩爾比(下圖)。擬合兩個獨立實驗的數據以計算解離常數(K d)。擬合參數的值在表3中顯示   。

表3由ITC測定的天然或瓜氨酸化LL-37與LPS之間相互作用的結合親和力,焓變和熵變。

瓜氨酸化的LL-37對陰離子磷脂的結合親和力降低

接下來,我們評估了瓜氨酸化對LL-37的結構和膜結合特性的影響。使用天然質譜,我們研究了瓜氨酸化是否會影響LL-37與常見細菌膜脂質結合的能力(圖   4)。簡而言之,將同時包含LL-37和LL-37 Cit5的溶液與包含POPE,POPC或POPG的兩性離子膠束混合,并進行MS分析。使用溫和的電離條件,可以通過質譜檢測溶液中形成的肽-脂質復合物,這使我們能夠直接確定LL-37和LL-37 Cit5的脂質結合和無脂質肽的比例(圖   4A)。)。我們觀察到,兩種肽都容易在相同程度上結合兩性離子去污劑以及兩性離子脂質POPE和POPC。然而,瓜氨酸化肽與天然LL-37相比,帶負電荷的POPG產生的復合物更少(圖   4B)。為了更好地了解脂質結合能力差異的起源,我們分析了天然LL-37和兩種瓜氨酸化形式(部分瓜氨酸化LL-37 Cit3和完全瓜氨酸化LL-37 Cit5)在生理(pH 7.5)和酸性(pH 4.5)條件下使用質譜進行分析。在生理pH下,所有三種肽均顯示相同的平均電荷。然而,在酸性pH下,未修飾的肽獲得明顯更高的電荷數量,而瓜氨酸化形式保持相同的低電荷狀態(圖   4C)。總之,我們的數據表明通過精氨酸瓜氨酸化降低肽的凈電荷會干擾其與帶負電荷的磷脂頭基相互作用的能力。

圖4
圖4

分析脂質與天然和瓜氨酸化的LL-37的結合。A)研究脂質與肽結合的實驗設計的示意圖。將由一種磷脂(POPC,POPE,POPG)和去污劑LDAO組成的膠束與天然和瓜氨酸化的LL-37混合。(B)從微團釋放的LL-37和LL-37 Cit5之間的結合能力的比較,顯示了游離肽和與磷脂結合的肽。C)在生理(綠色圓圈)和酸性(黃色圓圈)pH下肽的平均電荷。對具有相等方差的配對樣本執行了學生t檢驗(數據代表3個獨立實驗)。-以星號表示的值;(<0.05 *,<0.01 **,<0.001 ***,<0.0001 ****)。

與天然LL-37相比,瓜氨酸化LL-37顯示出更高的熱穩定性

為了進一步了解LL-37和LL-37 Cit5的折疊,二級結構和熱穩定性,使用了CD光譜法。CD譜在25℃下記錄在單獨的Milli-Q水,無任何緩沖器,用于兩種肽在協議揭示LL-37的主要無規卷曲光譜與以前的研究結果10,11和一個α螺旋頻譜LL-37 Cit5與在195 nm處有一個最大值,在222和208 nm處有兩個最小值,這是α螺旋二級結構的特征(圖   5A22。在25°C下添加10 mM PBS pH 7.4的緩沖液后,天然LL-37和LL-37 Cit5在三個不同濃度(15、50和100μM)下,α-螺旋二級結構(圖   5B和表   S2)與早期研究10一致。在10 mM pH 7.4的緩沖液中于95°C時,兩種肽均展開為隨機螺旋結構,并在冷卻至25°C后能夠在緩沖液中重新折回到原始的α螺旋結構(圖   5B)。熔融溫度(T m)是通過記錄在25到95°C,pH 7.4下在222 nm處的單個波長下的強度來估算的。對于100μMLL-37,T m估計約為69°C。較低濃度的LL-37(15μM和50μM)分別將熔融溫度降低至47°C和55°C(圖   5C),反映了寡聚肽聚集體9的濃度依賴性形成。100μMLL -37 Cit5的熔化溫度通常比天然LL-37高,熔點為73°C(圖   5D),而LL-37 Cit5的濃度較低15μM和50μM)。分別降低至54°C和67°C,這再次表明存在寡聚肽形式。在4.6的低pH下觀察到類似的α-螺旋二級結構和熱穩定性的結果(圖   S2)。一般而言,我們觀察到較高的肽濃度會導致較高的解鏈溫度。此外,瓜氨酸化提高了LL-37在pH 7.4下的熱穩定性。總體而言,這些結果表明,失去5個正電荷的LL-37 Cit5在其螺旋構型中溫度穩定性更高,這可能是由于肽內和肽間疏水相互作用增強的結果。

圖5
圖5

通過圓二色譜法分析不同條件下LL-37和LL-37 Cit5的構象變化。(A)僅在無緩沖液作用的水中記錄50 μM LL-37和50 μM LL-37 Cit5肽的CD光譜。在這些條件下,與LL-37 Cit5相反,天然LL-37顯示出無規卷曲結構。當添加緩沖液(10 mM,pH 7.4)時,天然LL-37立即形成α-螺旋二級結構。B在10 mM PBS緩沖液(pH 7.4)中記錄了100 μM LL-37和100 μM LL-37 Cit5肽的CD光譜。B中的數據點帶有灰色陰影區域)由于緩沖液的高吸光度而不可靠。將7點的平滑函數應用于光譜。天然LL-37(C)和LL-37 Cit5D的溫度熔解曲線的一階導數。在25–95°C的222 nm處的一個單一波長下記錄了肽的熱解鏈圖,以追蹤在PBS和磷酸鈉緩沖液中pH 7.4時展開的溫度依賴性。熔解曲線的一階導數的最大值對應于信號熔解曲線的中點,并且被解釋為熔解溫度(T m)。

帶負電荷的LUV增加了瓜氨酸化LL-37的螺旋含量

制備具有不同脂質組成的大單層囊泡(LUV),模擬原核膜,以研究模型膜對天然和瓜氨酸化LL-37肽二級結構的影響。LL-37和LL-37 Cit5的二級結構由有無LUV的CD確定。α-螺旋含量由222nm處的信號強度確定。在兩性離子POPC LUV的存在下,肽的CD光譜顯示LL-37的α-螺旋含量從34%降至31%(圖   6A)和LL-37 Cit5的從37%降至36%略有下降。(圖   6B),但θ 222208比例沒有變化。脂質體的負電荷增加至30%(POPC / POPG,7:3)不會改變天然LL-37的α-螺旋含量(圖   6A),而對于LL-37 Cit5,α-螺旋含量從36%略增至41%(圖   6B)。然而,θ之間的比例222208為天然LL-37增加了30%的脂質體。當脂質體的負電荷增加到70%(POPC / POPG,3:7)時,兩種肽的α-螺旋含量都增加了,從LL-37的36%增加到38%(圖   6A),從40對于LL-37 Cit5(圖   6B為%至45%。同樣,θ 222208本地LL-37的比例增加。總體上,我們觀察到帶負電荷的脂質體的存在對α-螺旋含量的影響較小,盡管瓜氨酸化LL-37的螺旋含量比天然肽的升高程度更高。革蘭氏陰性菌的外部小葉主要由LPS組成,因此,我們研究了在LPS分子存在下這兩種肽的二級結構。兩種肽均通過增加LPS濃度而顯示出螺旋度的輕微增加(圖   6C,D)。然而,在LL-37上滴定LPS改變了主要的一種典型的α-螺旋最小值(208 nm)的強度,而在LL-37 Cit5上滴定LPS 并沒有引起208 nm下最小值的任何實質性變化。一般而言θ的變化222208比建議在α螺旋結構的微小變化,有時通過所謂的螺旋超螺旋引起23。從理論上講,這可能意味著LL-37肽會在LPS表面發生聚集,而LL-37 Cit5不會。在最后的滴定步驟之后,將兩種肽在存在LPS的情況下隨時間孵育。LL-37 Cit5肽在孵育時間內是穩定的,而天然LL-37肽的光譜顯示在208 nm處信號強度的增加很?。▓D   S3)。

圖6
圖6

圓二色譜法分析LUV和LPS 中LL-37和LL-37 Cit5的構象變化。在室溫下,在不存在或存在1 mM LUV的情況下,在10 mM磷酸鉀緩沖液pH 7.4中記錄50 μM LL-37 (A)和50 μM LL-37 Cit5 (B)的 CD光譜。LUV由POPC:POPG(10:0),POPC:POPG(7:3)或POPC:POPG(3:7)組成。用CD光譜儀在25°C的10 mM磷酸鈉緩沖液pH 7.4中,在50 μM LL-37 (C)和50 μM LL-37 Cit5 (D)上滴定LPS 。對所有光譜應用3點的平滑功能。

討論區

在這里我們可以證明瓜氨酸化的LL-37確實存在于人的氣道中。這已被假定在以前的工作,但沒有正式證實15,24。為了檢測瓜氨酸LL-37,我們利用無細胞BAL幀內支氣管暴露于LPS之后從健康人類志愿者獲得流體21,25。我們發現,暴露于LPS的肺中的BAL液含有低水平但清晰可檢測的瓜氨酸化LL-37,這可通過使用針對LL-37 Cit5的內部多克隆血清來證明與靈敏的目標LC-MS / MS分析相結合進行驗證。盡管LL-37的片段化模式相當復雜,但我們能夠區分BAL流體餾分中的兩種瓜氨酸化形式的LL-37(LL-37 Cit3和LL-37 Cit5)。重要的是要注意,斑點印跡分析和LC-MS / MS分析都不能被認為是完全定量的,而應該用來確定樣品中肽的存在與否。因此,我們的數據提供了第一個概念驗證研究,其中直接在生物樣品中檢測到真正的瓜氨酸化形式的LL-37肽。但是,應該指出的是,針對LL-37 Cit5的多克隆抗血清對LL-37 Cit3具有交叉反應性(數據未顯示)。因此,不能排除最初的篩選揭示了瓜氨酸化LL-37的其他形式,由于分析的限制,我們無法用LC-MS / MS分析來區分。實際上,以前的論文表明,LL-37的幾種蛋白水解變體存在于人類表皮中26。結合瓜氨酸化增加LL-37的蛋白水解裂解的知識,我們也檢測到瓜氨酸化LL-37 15的幾種變體并不奇怪。

天然LL-37對多種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌12表現出抗菌活性。但是,對瓜氨酸化LL-37的研究是有限的。先前的研究表明LL-37 Cit5對革蘭氏陽性細菌肺炎鏈球菌金黃色葡萄球菌以及革蘭氏陰性的非典型流感嗜血桿菌顯示出弱的抗菌活性。此外,LL-37 Cit5表現出對銅綠假單胞菌的殺滅作用,但與天然LL-37 15相比,其作用略低。在這里,我們發現在多個精氨酸殘基上瓜氨酸化LL-37嚴重損害了對大腸桿菌的抗菌活性。甚至在濃度較高的情況下也能阻止細菌內膜的通透性(圖   2)。另外,我們發現,使用共聚焦顯微鏡,與天然的LL-37相比,熒光標記的LL-37 Cit5表現出與大腸桿菌結合的強烈降低(圖   2)。在這項研究中,我們還表明LL-37 Cit5甚至不會引起人紅細胞裂解,甚至高達20μM(圖   S1)。)。這表明天然肽中的正電荷對于抗菌活性至關重要。一般來說,AMP的細胞裂解活性的機理,主要是由于其結合到細胞表面,并以透導致細胞內容物的泄漏的膜,從而導致細胞死亡的能力11,27。通過一系列的生化和生物物理實驗,我們試圖剖析天然和瓜氨酸化的LL-37之間的差異。

首先,考慮到LL-37和細菌膜之間的初始相互作用被認為是靜電相互作用,我們研究了瓜氨酸化LL-37與LPS(革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分)之間的相互作用。盡管瓜氨酸化減少了肽的凈正電荷,但我們的ITC分析表明,天然和瓜氨酸化肽對LPS的結合親和力相似。但是,LL-37 Cit5和LPS 之間的相互作用略微轉變為較少的焓驅動結合以及較高的化學計量,這表明LL-37 Cit5的結合與天然LL-37和LPS之間的相互作用相比,LPS的本質上具有更大的疏水性并發生了變化。然而,這些結果與使用斑點印跡和共聚焦于活的完整細菌的結合研究不一致,這與大腸桿菌的殺死一致。來自ITC實驗的LPS結合數據可以通過LPS膠束與實際細菌膜不同的事實來解釋。另一個解釋可能是LPS的區域-可能是疏水區域,例如脂質A-可能會暴露于肽段,但不會附著在細菌膜上。因此,與LPS的結合似乎不足以殺死細菌,因為該肽需要向內膜移動才能引起透化作用。因此,我們的數據表明LL-37由于凈電荷的丟失,Cit5可能無法殺死大腸桿菌,從而阻止了肽在細菌外膜上的積累。但是,應注意,還有其他生物物理參數可能會影響肽對細菌的活性,例如疏水性,兩親性,低聚物形成以及靶膜的組成,這為肽-膜相互作用增加了另一層復雜性。

值得注意的是,其他研究表明瓜氨酸可改變LL-37的免疫調節活性,因為其中和巨噬細胞中和LPS誘導的促炎細胞因子的能力降低了15。據推測,這種活動減少是因為LL-37 Cit5不佳脂多糖結合,由于其凈電荷的損失,但直接LPS結合的形式證明未提供15,19。因此,LL-37 Cit5可能主要通過疏水相互作用結合LPS,并且由于失去凈電荷而仍然缺乏抗菌活性。在未來的研究中,研究LL-37 Cit5的結合位置可能會很有趣將LPS與天然LL-37進行比較,以進一步了解LL-37 Cit5大腸桿菌殺傷的抑制作用。

接下來,我們檢查了LL-37 Cit5與細菌磷脂(細菌膜的另一個重要組成部分)的相互作用。利用質譜技術,與天然LL-37相比,我們發現LL-37 Cit5與細菌膜的帶負電荷的磷脂的結合程度更低(如被POPG模仿)。CD對LL-37 Cit5的 CD分析表明,它在7.4的生理pH和4.6的較低pH均采用典型的α-螺旋結構,這表明單獨的電荷對于α-螺旋二級結構不是必需的。值得注意的是,天然LL-37需要螺旋折疊才能具有抗菌活性10,但是,LL-37 Cit5形成的螺旋不足以保留對大腸桿菌。

革蘭氏陰性細菌的外膜小葉主要由LPS組成,乳白細胞質膜由POPE制成,在較小程度上由POPG制成,這有助于細菌膜28的負凈電荷。以前的數據表明,LL-37與細菌仿膜相互作用并采用螺旋二級結構9,11,15,29,30。與這些結果一致,我們發現LL-37 Cit5以與肽的天然形式相似的方式與膜模型相互作用。綜合來看,我們的結果清楚地表明LL-37 Cit5大腸桿菌的活性不足,這很可能是由于凈費用減少所致。然而,盡管電荷減少,我們仍然觀察到LL-37 Cit5能夠結合LPS和細菌模仿磷脂。這個有點出乎意料的發現與瓜氨酸化肽的疏水性增加是一致的。

總之,我們在支氣管內暴露于LPS后,在健康志愿者的呼吸道中發現了LL-37的瓜氨酸化變體。實際上,這是首次在人類生物樣品中發現瓜氨酸化的LL-37。瓜氨酸化LL-37嚴重削弱了其對大腸桿菌的抗菌活性,最有可能是由于凈費用減少了。然而,瓜氨酸化的肽形成典型的α-螺旋結構并以類似于天然LL-37的方式結合LPS和細菌模擬膜,這可能是由于疏水相互作用。瓜氨酸化在人類呼吸道中可能起什么作用?一方面是考慮組蛋白的瓜氨酸化,這是基因轉錄的關鍵過程,但對于NETosis來說也是必不可少的,NETosis是抵抗細菌18的重要宿主防御機制。

先前的報道表明,LL-37可能在調節自身免疫性疾?。ㄈ缗Fぐ_,系統性紅斑狼瘡和關節炎)中的炎癥中起作用31。LL-37的瓜氨酸化已顯示出增加了對白細胞的趨化活性,而其中和LPS誘導的巨噬細胞活化的能力被抑制。此外,瓜氨酸抑制了LL-37對通過TLR2和TLR3 19調控信號轉導的抗炎作用。此外,瓜氨酸化會降低LL-37與DNA形成復合物的能力,進而影響細菌DNA激活樹突狀細胞和巨噬細胞的能力24。有趣的是,已經在銀屑病關節炎患者的滑液和血漿中發現了針對天然和瓜氨酸化的LL-37的自身抗體,這表明LL-37在這種疾病中起自身抗原的作用32。最近的一份報告顯示,在早期炎癥性關節炎中,循環中的LL-37與抗環瓜氨酸肽(anti-CCP)抗體相關,這表明LL-37可能與疾病的發展有關33。因此,LL-37的瓜氨酸化有可能代表附帶的和不想要的作用,從而大大改變該AMP的抗菌作用。另外,瓜氨酸化改變了LL-37的免疫調節功能,并且瓜氨酸化的LL-37有可能充當新抗原,從而破壞耐受性并驅動自身免疫過程。從積極的方面,可以相反地認為瓜氨酸化是“控制”基于AMP的過度反應的免疫系統的關鍵步驟。數據支持的假設表明,瓜氨酸化可以將LL-37變成蛋白水解酶的更好底物15。總之,我們的結果可以為研究瓜氨酸化的LL-37在傳染性和炎性疾?。ɡ绶窝?,敗血癥,慢性阻塞性肺疾病,牛皮癬和囊性纖維化)中的作用鋪平道路,也可以在正常生理學中發揮作用。

材料和方法

試劑種類

血瓊脂平板,磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和Luria Bertani(LB)從瑞典斯德哥爾摩卡羅林斯卡大學醫院的底物部門獲得。凍干的合成LL-37,瓜氨酸化LL-37肽(表   1),5-FAM-LL-37和若丹明B-LL-37 Cit5肽購自Innovagen(瑞典隆德),并溶于0.1%三氟乙酸(TFA) ),分裝并保存在?20°C直至使用。

支氣管內LPS暴露和支氣管肺泡灌洗液收集

無細胞BAL流體樣品從11執行的臨床研究的一部分,獲得 2003年11月至3 2008年12月21,25。此樣品收集構成的大項目的研究用和不用事先幀內支氣管LPS暴露于LPS,從其他結果已經呈現健康人呼吸道先天免疫應答的一部分21,25。這項臨床研究是在獲得倫理委員會在瑞典哥德堡的區域倫理審查委員會的批準后根據赫爾辛基宣言進行的(Dr. 618-02、065-04和683-07)。在納入研究之前,必須獲得書面知情同意。簡而言之,健康的志愿者通過支氣管鏡暴露于媒介物(,一只肺中的10 mL 0.9%PBS)和大腸桿菌E. coli)0113:H10(美國馬里蘭州羅克維爾)的LPS(4 ng / kg)),用PBS稀釋,放在另一肺中。分別暴露于賦形劑和LPS后12或24小時后,分別在各自的肺中進行BAL(3×50 mL PBS,37°C)。之后如在別處所述附加的處理21,25,將無細胞的BAL流體樣品保存在-80°C直至進一步使用。對于當前的研究,我們僅使用了暴露于LPS的肺中的BAL樣本。

從BAL液體樣品中提取肽/蛋白質

將來自暴露于LPS的氣道的BAL液樣品收集在一起(n = 10名健康志愿者的材料,總計14 mL),通過離心(5,000 rpm,15分鐘)清除碎屑,并用0.1%TFA復溶。利用OASIS 1cc反相HLB色譜柱(沃特世公司,美國馬薩諸塞州米爾福德),上清液富含肽和蛋白質。OASIS色譜柱用乙腈活化,并在上清液加樣之前在0.1%TFA水溶液中平衡。未結合的物質用0.1%TFA洗去,結合的物質用在0.1%TFA中的80%乙腈洗脫。將洗脫的級分在-80℃冷凍,凍干過夜,并在-20℃保存直至進一步使用。

反相液相色譜

肽/蛋白質提取物(0.5 mg)在Vydac C 8(250×4.5 mm)反相柱(HiChrom Ltd,UK)上以0.3 mL / min的流速分離。乙腈在0.1%TFA中的梯度逐漸增加(0–20%的16.6分鐘,20–60%的33.2分鐘和60–80%的66.2分鐘)進行洗脫。在214nm和280nm處監測吸光度。收集62 mL的1 mL餾分,立即冷凍(-80°C)并凍干。

LC-MS / MS分析

合成肽(LL-37和LL-37 Cit5)溶于2%乙腈/0.1%甲酸(溶劑A)中,并分別在線連接到Q Exactive質譜儀(Thermo Scientific,德國,不萊梅,Thermo Scientific,德國不來梅)上德國不來梅)。天然和瓜氨酸化的LL-37的合成肽用作確定其電離和斷裂特性的參考。在裝有10厘米內徑75 μm的PicoTip硅膠發射器(New Objective,Woburn,2000年)的ReproSil-Pur C8、3 μm顆粒(德國Ammerbuch的Maisch博士)填充的分析柱上完成肽的色譜分離。美國馬薩諸塞州)。為了分離肽段,應用乙腈濃度遞增的梯度(5分鐘為4–25%,5分鐘為25–70%,5分鐘為70–95%,95%為8分鐘)。 300 nL /分鐘m / z 300到1650,同時針對包含物質量列表中定義的三個前體m / z值(LL-37:m / z 749.4365 [M + 6 H] 6+; LL-37 Cit3m / z 899.7128 [M + 5 H] 5+; LL-37 Cit5m / z 900.1064 [M + 5 H] 5+)。高碰撞解離(HCD)在35%歸一化碰撞能量下的質量分辨率設置為17.500(在m / z 200處),以15 m / z 1.6的寬度分離出的15個最強前體離子碎片化,目標是10 5?離子。將凍干的BAL流體餾分溶于20 μL溶劑A中,并將2 μL注入色譜柱中。在Skyline v.4.2(華盛頓大學MacCoss實驗室)中對獲取的數據進行了分析。

色譜部分的斑點印跡分析

對于斑點印跡分析,將凍干的色譜級分溶解在30μL0.1%TFA中,并將每個級分中的1μL分散在Hybond Super C膜上(Amersham,GE Healthcare UK Ltd.,Little Chalfont,英國)。將膜在含0.25%Tween-20的5%脫脂牛奶中封閉,然后在4°C下與任一抗LL-37的一抗小鼠單克隆抗體(1.2 mg / mL;在PBS中以1:2000的比例稀釋)孵育過夜5%無脂牛奶)34或具有針對LL-37 Cit5的親和純化多克隆血清(Innovagen(瑞典隆德)的PBS溶液(5.4毫克/毫升1:2000稀釋,含5%無脂牛奶))。隨后,在洗滌步驟之后,將膜與偶聯至辣根過氧化物酶的二級抗體(Sigma-Aldrich,密蘇里州圣路易斯,美國,美國)一起孵育(1小時,RT)。該信號由ECL主系統(Amersham,GE Healthcare UK Ltd.)開發,并由Syngene數字成像系統(Syngene,英國劍橋)檢測。使用GeneSys軟件(Syngene,英國劍橋)調整免疫印跡圖像。

細菌培養

大腸桿菌 ATCC 29522(大腸桿菌)是從卡羅林斯卡大學醫院的臨床微生物學實驗室獲得的。細菌在37°C搖晃(200 rpm)下于Luria Bertani(LB)肉湯中生長,達到對數中期,此后,在每次實驗前,將細菌懸浮液稀釋到同一生長培養基中的起始細菌接種物中。

菌落計數測定

通過進行菌落計數測定來評估LL-37和瓜氨酸化的LL-37肽(表1的抗菌活性   。大腸桿菌在LB中生長至對數中期,然后稀釋至5×10 7 CFU / mL。將細菌與不同的肽濃度(0至80μM)在37°C下孵育3小時。隨后,將混合物連續稀釋并點樣(20μL)在血瓊脂平板上。在37°C過夜孵育后,對存活細菌進行計數。

Sytox綠色吸收測定

為了評估內膜通透性,將5×10 7 CFU / mL活或熱殺死的大腸桿菌與LL-37或LL-37 Cit5在LB中于37°C 孵育 30分鐘。孵育后,將細菌在4°C下以1200×g離心10分鐘,然后在PBS中洗滌。接下來,將細菌用3μMSYTOX綠色核酸染色劑(Thermo Fisher Scientific,沃爾瑟姆,馬薩諸塞州,美國)重懸于PBS中,并轉移到黑色96孔板中。在室溫下孵育5分鐘后,使用TECAN微孔板讀數器測量兩個波長(λex 504 nm和λem 523 nm)的熒光強度。

透射電子顯微鏡

使大腸桿菌生長至對數期,并在LB中稀釋至5×10 8 CFU / mL。為了適應電子顯微鏡所需的更高細菌濃度,進行了額外的菌落計數測定,以定義在該細菌濃度下LL-37的抗菌能力。LL-37的最低抑菌濃度為50μM。相反,即使在較高濃度(200μM)下,LL-37 Cit5也沒有表現出任何殺滅作用。未經處理的細菌用作對照,并與LL-37或LL-37 Cit5孵育在37°C下以不同濃度(50μM或200μM)混合0.5或2 h。將混合物在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的2.5%戊二醛中于室溫固定30分鐘,然后在0.1 M磷酸鹽緩沖液中沖洗,然后在4°C下使用0.1%磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的2%四氧化os進行后固定。 C 2小時。接下來,樣品先在乙醇中脫水,然后在丙酮中脫水,最后包埋在LX-112中。使用Leica EM UC7(德國Wetzlar的Leica Microsystems GmbH)制備超薄切片,然后使用醋酸鈾酰作為對比劑,然后使用雷諾茲檸檬酸鉛。在Tecnai Spirit G2 Bio TWIN電子顯微鏡(Tecnai High-Technologies)上以100 kV檢查切片,并使用2kx2k Veleta CCD相機(德國明斯特的Olympus Soft Imaging Solutions GmbH)獲取圖像。

共聚焦顯微鏡

為了進行共聚焦顯微鏡檢查,將10 7 CFU / ml 大腸桿菌與標記的肽5-FAM-LL-37或若丹明B-LL-37 Cit5(Innovagen)在LB中于37°C孵育1小時。孵育后,細菌以5,000× g離心?保持2分鐘并在PBS中洗滌兩次。接下來,將細菌在室溫下于2%PFA(Sigma-Aldrich)中固定30分鐘。洗滌細菌并將其重懸于PBS中,然后吸移到顯微鏡載玻片上,風干,熱固定,并安裝在ProLong Gold Antifade貼壁劑(Thermo Fisher Scientific)中。使用Olympus FluoView軟件在Olympus FluoView FV1000共聚焦激光掃描顯微鏡上進行共聚焦成像。使用ImageJ / FIJI軟件(美國馬里蘭州貝塞斯達的國立衛生研究院)進行圖像分析。

溶血測定

人體血液收集在肝素鈉血液收集管(英國普利茅斯的Becton Dickinson)中。將全血在室溫下以800× g離心? 10分鐘。丟棄血漿,并用PBS(pH 7.4)洗滌紅細胞3次,然后重懸于1%(體積/體積)的PBS溶液中。在U型底板上分析紅細胞,將其與不同的肽濃度(1.25–20 μM)混合,并在37°C攪拌下孵育1小時。將板以800× g離心?10分鐘后,將80 μL上清液轉移至透明的平底96孔板中,以使用Tecan Infinite M200微孔板讀數器測量在540 nm處釋放的血紅蛋白的吸光度。使用陰性(無肽)作為0%裂解和陽性對照(1%Triton X-100)作為100%裂解來計算溶血百分比。

等溫滴定熱法

用低體積NanoITC(TA Instruments-Waters LLC,New Castle,DE,美國)進行等溫滴定熱法(ITC)。在50 μL注射器中裝滿0.1%TFA(Sigma-Aldrich)中的200 μM LL-37或200 μM LL-37 Cit5,以滴定到164 μL的62.5 μM 大腸桿菌 O111:B4 LPS(InVivoGen,圣地亞哥,加利福尼亞) (美國)中加入0.1%TFA(Sigma-Aldrich)。以300 s的間隔注射2 μL滴定液,使其逐漸增加。實驗在37°C下進行。使用NanoAnalyze軟件(TA Instruments-Waters LLC,美國新城堡)分析數據。

質譜

在進行MS分析之前,將天然肽和瓜氨酸化肽均在1 M pH 7.5的乙酸銨或0.1%pH 4.5的乙酸中稀釋十倍。對于脂質結合實驗,將肽段稀釋在1 M的乙酸銨(pH 7.5)中,其中含有4 mM的十二烷基二甲基胺N-氧化物(LDAO)清潔劑,最終濃度為5 μM。簡而言之,兩性離子(中性電荷)1-棕櫚?;?2-油?;?sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC),1-棕櫚?;?2-油?;?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)和帶負電荷從Avanti Polar Lipids(Alabaster,Alabama,USA)獲得1-棕櫚酰-2-油?;?sn-甘油-3 [磷酸-rac-(1-甘油)](POPG),每種化合物的制備濃度為800 μM。 Milli-Q水。為了進行結合研究,將每種磷脂添加到LDAO中的肽混合物中,使其最終濃度為80 μM。在配備有離線納米電噴霧源的Orbitrap Fusion(Thermo Fisher Scientific,馬薩諸塞州沃爾瑟姆)上記錄質譜。使用鍍金的Proxeon硼硅酸鹽毛細管(Thermo Scientific,Waltham,MA)引入樣品。以正電離模式記錄光譜,毛細管電壓為1.8 kV,源溫度為80°C。使用Xcalibur軟件3.0軟件包(Thermo Scientific)分析數據。在Microsoft Excel中對具有相等方差的配對樣本進行了學生的T檢驗。8 kV,源溫度為80°C。使用Xcalibur軟件3.0軟件包(Thermo Scientific)分析數據。在Microsoft Excel中對具有相等方差的配對樣本進行了學生的T檢驗。8 kV,源溫度為80°C。使用Xcalibur軟件3.0軟件包(Thermo Scientific)分析數據。在Microsoft Excel中對具有相等方差的配對樣本進行了學生的T檢驗。

圓二色性(CD)

樣品制備

將合成的凍干LL-37和LL-37 Cit5肽溶解在Milli-Q水中,該肽的濃度由干粉的重量確定。在10–50 mM PBS,檸檬酸緩沖液,磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液中制備進一步的稀釋液,以獲得用于實驗的最終肽濃度。

脂質體制劑

為了模擬生理膜中磷脂的功能,使用了大的單層磷脂囊泡(LUV)。LUVs是根據先前發布的方案制備的35。簡而言之,將中性POPC和帶負電荷的POPG混合至最終磷脂濃度為5 mM(對于30%帶負電荷的LUV,使用7:3的POPC / POPG摩爾比,對于70%帶負電荷的LUV,POPC / POPG 3使用:7:100,對于100%中性LUV使用POPC 10:0。在氮氣流下將氯仿蒸發至少一小時。然后將脂質膜重懸于50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)中并渦旋10分鐘以形成多層囊泡。為了獲得單層囊泡,將脂質溶液在液氮中冷凍,并以五次冷凍/解凍循環在熱水中解凍,然后通過100 nm的Avanti小型擠出機(Avanti Polar Lipids,Alabaster,阿拉巴馬州,美國)聚碳酸酯孔徑過濾器(Avanti極性脂質,Alabaster,Alabama,美國)至少21次。將LUVs溶液進一步在pH 7.4的磷酸鉀緩沖液中稀釋,以獲得1 mM的最終濃度。

LPS膠束制備

來自大腸桿菌 O111:B4的凍干LPS 獲自Sigma Aldrich。通過將凍干的LPS溶解在Milli-Q水中制備200 μM LPS膠束的儲備溶液。將儲備溶液渦旋一分半鐘。使用20kDa的LPS分子量通過重量確定LPS濃度。

圓二色性(CD)光譜

CD光譜和溫度掃描在具有Peltier溫度控制系統的Chirascan CD光譜儀(Applied Photophysics,Leatherhead,UK)上記錄。使用光程為1 mm的石英比色皿。通過在靜止條件下記錄190-260 nm光譜范圍,帶寬為1 nm,步長/分辨率為0.5或1 nm,每點時間為190 nm的CD光譜來研究肽的二級結構。 0.5或4 s。減去緩沖液的背景光譜,并將數據表示為平均殘余物摩爾橢圓率。每點時間為0.5 s的所有數據都使用三點或七點的平滑功能進行處理。肽的濃度(15–100 μM),pH(4.6和7.4)和溫度(5–95°C)均發生變化,并跟蹤肽二級結構的變化。對于膜模擬實驗,在室溫下在10 mM磷酸鉀緩沖液pH 7.4中使用1 mM LUV。在25 mC的10 mM磷酸鈉緩沖液pH 7.35中,將LPS(10–50 μM)滴定到50 μM肽溶液中。在最終的50 μM LPS滴定步驟之后,將帶有肽和LPS的樣品在25°C下孵育70分鐘,同時每十分之一分鐘記錄一次光譜。減去緩沖液中每個LPS濃度的背景光譜后顯示光譜。計算α-螺旋含量(式 在最終的50 μM LPS滴定步驟之后,將帶有肽和LPS的樣品在25°C下孵育70分鐘,同時每十分之一分鐘記錄一次光譜。減去緩沖液中每個LPS濃度的背景光譜后顯示光譜。計算α-螺旋含量(式 在最終的50 μM LPS滴定步驟之后,將帶有肽和LPS的樣品在25°C下孵育70分鐘,同時每十分之一分鐘記錄一次光譜。減去緩沖液中每個LPS濃度的背景光譜后顯示光譜。計算α-螺旋含量(式1)被使用36

α-H?一世C一種C??????[]=θ222?,[R一種?d?C?一世-θ222?,?bs?[Rv?dθ222?,[R一種?d?C?一世-θ222?,α-H?一世X?100,
(1)

其中隨機線圈結構(θ222 nm,隨機線圈的平均橢圓率是3.900 deg cm 2 dmol -1和α螺旋(θ222 nm,α-helix的平均橢圓率是-35.700 deg cm 2 dmol -1。

在不同的肽濃度和pH下LL-37和LL-37 Cit5肽的解鏈,隨后是在25–95°C的溫度范圍內隨溫度變化的222 nm橢圓率。由于222 nm處的典型α螺旋最小值,因此選擇了一個單一波長222 nm。橢圓率的測量步長為1°C,速率為5°C min -1或0.3°C min -1。222 nm處的橢圓率變化可用于計算展開的熱力學參數。通過數據點的S形曲線擬合(公式2確定每種條件   的熔化溫度T m。第t 從曲線的一階導數計算出值,其中最大值對應于溫度掃描中點(T m)。

F?=一種+-一種1個+經驗值?[?-?w]
(2)

其中,A是熔解曲線的幅度,B是基線,T m是熔解溫度的中點,w是曲線的斜率。

統計分析

將CFU計數數據進行對數轉換,并進行不成對的多重T檢驗。數據表示為平均值±SEM。一個p的≤0.05 -值被認為是統計上顯著。使用GraphPad Prism 7.0e版(GraphPad,拉荷亞,CA)進行統計分析。



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